Determinación cuantitativa de hemoglobina

 Determinación cuantitativa de hemoglobina

 

Objetivo: Determinación cuantitativa de la hemoglobina.

Fundamento:La hemoglobina es oxidada por la acción del ferricianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina.
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la muestra ensayada

Materiales: 

• Espectrofotómetro.
• Gradilla.
• Tubos de ensayo.
• Micropipeta.
• Puntas de micropipeta.
• Pipeta graduada.
• Auxiliar de pipeteo.
• Papel de filtro.
• Pipeta pasteur.
• Rotulador permanente.
• Piseta.
• Vaso de precipitado. 
• Cubetas.
  

  Reactivos: 

• Reactivo Drabkin.
• Hemoglobin.
  

Muestra: 

• Sangre anticoagulada con EDTA, heparina u oxalato.

Procedimiento: 

1. Preparamos 3 tubos de ensayo, los rotulamos, uno será para el blanco, otro para el patrón y el último para la muestra, y los colocamos en la gradilla.
   
   
   
2.  Para pipetear hemos utilizado el método macro, para ello en cada uno de estos tubos vertemos, con la pipeta y el auxiliar de pipeteo, 4,9 ml de agua destilada y 2 gotas del reactivo Drabkin.
   
   
   
3. Con la micropipeta tomamos 20 L de Hemoglobin, y los vertemos en el tubo de la sustancia patrón, ahora tomamos 20 L de sangre anticoagualada y los vertemos en el tubo de la muestra.
   
   
   
4. Movemos los tubos, para que se produzca la mezcla de sus componentes y los incubamos a temperatura ambiente durante 3-5 minutos.
5.  Pasamos con una pipeta pasteur, el contenido de los tubos a unas cubetas y las introducimos en el espectrofotómetro, junto a otra cubeta con agua destilada.
   
   
   
6. Realizamos las lecturas de las absorbancias poniendo el espectrofotómetro a una longitud de onda de 540nm, de cada una de nuestras cubetas, para ello pulsamos el botón goto, y seleccionamos el valor que deseemos, s y realizamos el calculo de los resultados, para obtener una gráfica.
   
   
   

Resultados:

Hemos realizado 2 determinaciones en la primera hemos utilizado un patrón de hemoglobina de 20 mg/dl y en la segunda determinación un patrón de hemoglobina de 15mg/dl y los resultados han sido los siguientes: 

 Con estos datos datos realizamos los cálculos con patrón:

0.230 - 0,006/0,123-0,006 x 20= 38,28 

Con estos datos realizamos los calculos con patrón:

0,096 - 0,002/0,287-0,002 x 15= 4,94

 

 Interferencias:

Hay varias drogas y otras sustancias, que interfieren en la determinación de la hemoglobina. 

Observaciones:

• Poner en orden las cubetas dentro del espectrofotómetro, para saber la cubeta en la que estamos midiendo la absorbancia. 
• Rotular las cubetas.
• Pipetear los volúmenes adecuados de cada uno de los reactivos utilizados.
• Seleccionar la longitud de onda adecuada en el espectrofotómetro.
• Fijarnos en la concentración del patrón, para seleccionar la concentración adecuada para realizar nuestra determinación.
• Utilizar sangre anticoagulada.
  

Normas de prevención: 

• Utilizar los EPIS correspondientes, para realizar la práctica.
• Depositar los residuos generados durante la realización de la práctica, en los contenedores adecuados.
• Limpiar, desinfectar y esterilizar los materiales utilizados cuando terminos de realizar la práctica.