Determinación cuantitativa de fibrinógeno

 Determinación cuantitativa de fibrinógeno

 

Fundamento: El fibrinógeno, en presencia de un exceso de trombina, se transforma en fibrina. 

El tiempo de formación del coágulo es inversamente proporcional a la concentración de Fibrinógeno presente en la muestra de plasma.

La determinación de fibrinógeno por el tiempo de coagulación de trombina, está basada en el método descrito por Clauss. En presencia de altas concentraciones de trombina, el tiempo necesario para la formación del coágulo en el plasma diluido es inversamente proporcional a la concentración de fibrinógeno.

Material: 

•  Coagulómetro.
•  Micropipeta de 10цl y 1000цl.
•  Puntas de micropipeta.
• Gradilla.
• Tubo de ensayo. 
• Piseta.
• Cubetas de coagulómetro.
  

Reactivos: 

• R1:Trombina bovina.
• R2: Tampón Imidazol, Azida sódica.
• R3: Solución Caolín.
• Plasma citrado.

Procedimiento:

Esta prueba se realiza en el coagulómetro, que nos permite detectar la formación de un coágulo, y del tiempo que tarda en hacerlo. 

1. Para realizar esta prueba lo primero que haremos será encender el coagulómetro, mediante el botón de la parte de atrás del coagulómetro, y esperaremos a que aparezca un asterisco, que indica que se ha alcanzado la temperatura óptima de 37º. Los botones con los símbolos de flecha nos permitirán elegir el programa, en este caso sera FB.
   
2. Una vez encendido el coagulómetro, para esta prueba realizaremos unas preparaciones: - El reactivo R1, se tiene que reconstituir con 2 ml de agua (fijarnos en el bote, por si fuera otra cantidad), se tapa y se mezcla hasta disolver su contenido.
3. El reactivo R2 se debe agitar antes de usarlo y el reactivo R3 esta ya preparado para ser utilizado.
4. En una cubeta añadimos con una micropipeta 50 цl de plasma citrado, junto a 450 цl de reactivo R2, de esta dilución sacamos 200 цl y lo vertemos en otra cubeta de coagulación, donde verteremos 20 цl de reactivo R3.
5. Esta cubeta con las tres sustancias, la pondremos en la gradilla del coagulómetro a 37º C durante unos 5 minutos y colocaremos también una mosca.
6. Cuando hayan pasado los 5 minutos, preparamos una micropipeta con 100 цl de R1 con la punta de la micropipeta amarilla.
7. Colocamos la cubeta con las 3 sustancias, a la gradilla de medición del coagulómetro y colocamos sobre ella, el tapón negro agujereado.
8. Colocamos la punta de la micropipeta en el interior del orificio, pulsamos el botón RESET, esperamos que aparezca en la pantalla 00:00, y en ese momento vertemos 100 цl del R1, que tenemos en la micropipeta, para que comience la reacción de coagulación.
9. Dejamos que pase el tiempo, y cuando pare el temporizador, se producirá la formación del coágulo, que en nuestro caso ha sido de 50 segundos.
10. Una vez anotado el tiempo, sacamos la cubeta , desinfectamos el contenido con alcohol, lavamos la cubeta y la mosca con jabón.

 Interferencias:

Se han observado intereferencias en muestras con productos de degradación del fibrinogeno. Las reacciones inflamatorias agudas, pueden aumentar el fibrinógeno circulante. La hemolisis puede causar activación de los factores de coagulación e interferir en la detección del punto final. Los niveles altos de paraproteína y de fármacos que activan el sistema fibrinolítico pueden interferir en las determinaciones de fibrinógeno. Se han descrito varias drogar y otras sustancias que interfieren en su determinación.

Resultado:

Para esta prueba hemos obtenido un tiempo de 50 segundos para que se produzca la coagulación, por lo que la concentración en g/l es de 1,52. Con estos datos realizamos la curva

 Observaciones:

• Fijarnos en la cantidad que nos aparezca en el bote de R1 para añadir la cantidad adecuada de agua, para que se disuelva su contenido.
• Seleccionar mediante las teclas de dirección el programa Fb, que es la determinación que vamos a realizar en esta práctica.
• Utilizar las cantidades adecuadas de cada reactivo, para realizar la determinación.
• Atemperar en las gradillas del coagulometro, las diferentes soluciones antes de realizar la medición.
• No añadir el reactivo R1, hasta que en la pantalla del coagulómetro aparezca 00:00.
• Apuntar los segundos obtenidos al realizar la coagulación,  para poder realizar la curva de fibrinógeno.
• Utilizar una punta de micropipeta diferente para verter cada reactivo.
• Añadir a la mezcla de plasma citrado los reactivos adecuados.
• No olvidar colocar la mosca para realizar la coagulación.
• Fijarnos en la concentración del patrón que aparece en las instrucciones y botes de reactivos.  

Normas de prevención: 

• Utilizar los EPIS correspondientes, para realizar la práctica.
• Depositar los residuos generados durante la realización de la práctica, en los contenedores adecuados.
• Limpiar, desinfectar y esterilizar los materiales utilizados y lavamos las cubetas y la mosca con jabón, cuando terminos de realizar la práctica.